Noorganik va organik muhitlar tomonidan yorug'likning yutilishi va keyingi qayta emissiyasi fosforessensiya yoki floresans natijasidir. Hodisalar orasidagi farq yorug'likning yutilishi va oqimning emissiyasi orasidagi intervalning uzunligidir. Floresans bilan bu jarayonlar deyarli bir vaqtda va fosforessensiya bilan biroz kechikish bilan sodir bo'ladi.
Tarixiy ma'lumot
1852-yilda ingliz olimi Stoks birinchi marta flüoresansni ta'riflagan. U yangi atamani ultrabinafsha nurlar ta'sirida qizil yorug'lik chiqaradigan florspat bilan o'tkazgan tajribalari natijasida yaratgan. Stokes qiziqarli hodisani qayd etdi. U lyuminestsent yorug'likning to'lqin uzunligi har doim qo'zg'atuvchi yorug'likdan uzunroq ekanligini aniqladi.
Gipotezani tasdiqlash uchun 19-asrda koʻplab tajribalar oʻtkazildi. Ular turli xil namunalar ultrabinafsha nurlar ta'sirida lyuminestsatsiyalanishini ko'rsatdi. Materiallar, jumladan, kristallar, qatronlar, minerallar, xlorofill,dorivor xom ashyo, noorganik birikmalar, vitaminlar, yog'lar. Biologik tahlil uchun bo'yoqlardan to'g'ridan-to'g'ri foydalanish faqat 1930 yilda boshlangan
Flüoresan mikroskop tavsifi
20-asrning birinchi yarmida tadqiqotda foydalanilgan ba'zi materiallar juda aniq edi. Kontrastli usullar bilan erishib bo'lmaydigan ko'rsatkichlar tufayli floresan mikroskopiya usuli ham biomedikal, ham biologik tadqiqotlarda muhim vositaga aylandi. Olingan natijalar materialshunoslik uchun katta ahamiyatga ega emas edi.
Flüoresan mikroskopning qanday afzalliklari bor? Yangi materiallar yordamida yuqori o'ziga xos hujayralar va submikroskopik komponentlarni ajratib olish mumkin bo'ldi. Floresan mikroskop alohida molekulalarni aniqlash imkonini beradi. Turli xil bo'yoqlar bir vaqtning o'zida bir nechta elementlarni aniqlash imkonini beradi. Uskunaning fazoviy o'lchamlari diffraktsiya chegarasi bilan cheklangan bo'lsa-da, bu o'z navbatida namunaning o'ziga xos xususiyatlariga bog'liq bo'lsa-da, bu darajadan past bo'lgan molekulalarni aniqlash ham juda mumkin. Turli xil namunalar nurlanishdan keyin avtofluoresansni ko'rsatadi. Bu hodisa petrologiya, botanika, yarimo'tkazgich sanoatida keng qo'llaniladi.
Xususiyatlar
Hayvon to'qimalari yoki patogen mikroorganizmlarni o'rganish ko'pincha juda zaif yoki juda kuchli o'ziga xos bo'lmagan avtofluoresans bilan murakkablashadi. Biroq, qiymattadqiqot ma'lum bir to'lqin uzunligida qo'zg'atilgan va kerakli intensivlikdagi yorug'lik oqimini chiqaradigan komponentlarni materialga kiritishni o'z ichiga oladi. Ftoroxromlar tuzilmalarga (ko'rinmas yoki ko'rinadigan) o'z-o'zidan biriktirilishi mumkin bo'lgan bo'yoqlar sifatida ishlaydi. Shu bilan birga, ular maqsadlarga nisbatan yuqori selektivligi va kvant rentabelligi bilan ajralib turadi.
Flüoresan mikroskopiya tabiiy va sintetik boʻyoqlarning paydo boʻlishi bilan keng qoʻllanila boshlandi. Ular maxsus emissiya va qoʻzgʻalish intensivligi profillariga ega boʻlib, aniq biologik maqsadlarga qaratilgan edi.
Alohida molekulalarni aniqlash
Ko'pincha ideal sharoitlarda siz bitta elementning yorqinligini qayd qilishingiz mumkin. Buning uchun, boshqa narsalar qatorida, etarlicha past detektor shovqini va optik fonni ta'minlash kerak. Flüoresan molekulasi fotooqartirish tufayli halokatdan oldin 300 000 tagacha foton chiqarishi mumkin. 20% yig'ish tezligi va jarayon samaradorligi bilan ular taxminan 60 ming
miqdorida ro'yxatga olinishi mumkin.
Koʻchki fotodiodlari yoki elektronlarni koʻpaytirishga asoslangan lyuminestsent mikroskop tadqiqotchilarga alohida molekulalarning harakatini soniyalar, baʼzi hollarda esa daqiqalar davomida kuzatish imkonini berdi.
Qiyinchiliklar
Asosiy muammo optik fondan shovqinni bostirishdir. Filtrlar va linzalarni qurishda ishlatiladigan ko'plab materiallar ma'lum bir avtofluoresansga ega bo'lganligi sababli, olimlarning sa'y-harakatlari dastlabki bosqichlarda ishlab chiqarishga qaratilgan.past floresan bilan komponentlar. Biroq, keyingi tajribalar yangi xulosalarga olib keldi. Xususan, umumiy ichki aks ettirishga asoslangan lyuminestsent mikroskop past fon va yuqori qo‘zg‘aluvchan yorug‘lik chiqishiga erishishi aniqlandi.
Mexanizm
To'liq ichki aks ettirishga asoslangan lyuminestsent mikroskopiya tamoyillari tez parchalanadigan yoki tarqalmaydigan to'lqindan foydalanishdir. U turli xil sinishi ko'rsatkichlariga ega bo'lgan muhitlar orasidagi interfeysda paydo bo'ladi. Bunday holda yorug'lik nuri prizmadan o'tadi. U yuqori sinishi indeksiga ega.
Prizma suvli eritma yoki past parametrli oynaga ulashgan. Agar yorug'lik nuri unga tanqidiy burchakdan kattaroq burchak ostida yo'n altirilsa, nur butunlay interfeysdan aks etadi. Bu hodisa, o'z navbatida, tarqalmaydigan to'lqinni keltirib chiqaradi. Boshqacha qilib aytganda, 200 nanometrdan kamroq masofada sinishi indeksi pastroq muhitga kirib boradigan elektromagnit maydon hosil bo'ladi.
Tarqalmaydigan toʻlqinda yorugʻlik intensivligi ftoroforlarni qoʻzgʻatish uchun yetarli boʻladi. Biroq, uning chuqurligi juda kichik bo'lganligi sababli, uning hajmi juda kichik bo'ladi. Natijada past darajadagi fon.
Modifikatsiya
To'liq ichki aks ettirishga asoslangan lyuminestsent mikroskopiya epi-yoritilishi bilan amalga oshirilishi mumkin. Buning uchun kattalashtirilgan raqamli diafragma (kamida 1,4, lekin u 1,45-1,6 ga yetishi ma'qul), shuningdek, apparatning qisman yoritilgan maydoni bo'lgan linzalarni talab qiladi. Ikkinchisiga kichik nuqta bilan erishiladi. Kattaroq bir xillik uchun nozik halqa ishlatiladi, bu orqali oqimning bir qismi bloklanadi. To'liq aks etish sodir bo'lgan kritik burchakka ega bo'lish uchun linzalar va mikroskop qopqog'i oynasidagi immersion muhitning yuqori darajada sinishi kerak.
