DNK gibridizatsiyasi asosida nima yotadi? Ikki zanjirli DNK ketma-ketligi odatda fiziologik sharoitda barqaror bo'lsa-da, bu sharoitlarni laboratoriya sharoitida o'zgartirish (odatda atrof-muhit haroratini oshirish orqali) molekulalarning alohida zanjirlarga ajralishiga olib keladi. Ikkinchisi bir-birini to'ldiradi, lekin o'z muhitida mavjud bo'lgan boshqa ketma-ketliklarni ham to'ldirishi mumkin. Atrof-muhit haroratini pasaytirish bir zanjirli molekulalarning bir-biri bilan tavlanishi yoki "gibridlanishi" imkonini beradi. Bu DNK gibridizatsiyasi usuli.
Molekulyar biologiya nuqtai nazaridan tushuncha
DNK replikatsiyasi va DNKning RNKga transkripsiyasi bilan shug'ullanuvchi olimlar nukleotidlar kesishishi va molekulyar biologiya usullariga tayanadilar. Bunga janubiy va shimoliy blotlar, polimeraza zanjiri reaktsiyasi (PCR) va aksariyat DNK-RNK gibridizatsiyasi va sekvensiya yondashuvlari kiradi.
Ilova
Gibridlanish nukleotidning asosiy xossasidirketma-ketliklar va molekulyar biologiyaning ko'plab usullarida qo'llaniladi. Ikki turning umumiy genetik aloqasini ularning DNK segmentlarini gibridlash (DNK-DNK gibridizatsiyasi) orqali aniqlash mumkin. Bir-biriga yaqin bo'lgan organizmlar o'rtasidagi ketma-ketlik o'xshashligi tufayli bunday DNK duragaylarini eritish uchun uzoqroq organizmlarga nisbatan yuqori harorat talab qilinadi. DNK namunasining kelib chiqishini aniqlash uchun turli usullar, shu jumladan polimeraza zanjiri reaktsiyasi (PCR) gibridizatsiyasidan foydalanadi. Boshqa usulda, qisqa DNK ketma-ketliklari ifodalangan genlarni aniqlash uchun hujayrali mRNKga gibridlanadi. Farmatsevtika kompaniyalari ribosomaning mRNKni oqsilga aylantirishiga yo'l qo'ymaslik uchun keraksiz mRNK bilan bog'lanish uchun antisens RNKdan foydalanishni o'rganmoqda.
DNK-DNK gibridizatsiyasi odatda DNK ketma-ketliklari hovuzlari orasidagi genetik o'xshashlik darajasini o'lchaydigan molekulyar biologiya texnikasiga ishora qiladi. Odatda ikki organizm orasidagi genetik masofani aniqlash uchun foydalaniladi. U filogeniya va taksonomiyada keng qo'llanilgan.
Metodologiya
Bitta organizmning DNKsi etiketlangan, so'ngra unga qiyoslanishi mumkin bo'lgan yorliqsiz DNK bilan aralashtiriladi. Aralash DNK zanjirlarining ajralishini ta'minlash uchun inkubatsiya qilinadi va keyin regeneratsiyalangan gibrid ikki zanjirli DNK hosil qilish uchun sovutiladi. Yuqori darajadagi o'xshashlikka ega bo'lgan gibridlangan ketma-ketliklar yanada qattiqroq bog'lanadi va ularni ajratish uchun ko'proq energiya talab qilinadi: ya'ni ular yuqori haroratda qizdirilganda ajralib chiqadi.harorat oʻxshash ketma-ketliklardan koʻra, bu jarayon “DNK erishi” deb nomlanadi.
DNK erishi
Gibridlangan DNKning erish profilini baholashda ikki zanjirli DNK "ustun" deb ataladigan narsaga bog'lanadi va hosil bo'lgan aralash isitiladi. Har bir bosqichda ustun yuviladi va erigan DNK ketma-ketliklari bir ipga aylanadi va ustundan yuviladi. Belgilangan DNK ustundan chiqadigan haroratlar ketma-ketliklar orasidagi o'xshashlik miqdorini aks ettiradi (va o'z-o'zidan katlanadigan naqsh nazorat vazifasini bajaradi). Ushbu natijalar organizmlar o'rtasidagi genetik o'xshashlik darajasini aniqlash uchun birlashtiriladi. Zamonaviy mikrobiologiyaga ko'ra, bu narsalarni tushunmasdan DNKni duragaylash mumkin emas.
Bir nechta ribonuklein kislota (yoki deoksiribonuklein) kislota turlari shu tarzda solishtirilganda, o'xshashlik qiymatlari turlarni filogenetik daraxtga joylashtirish imkonini beradi. Shuning uchun bu molekulyar sistematikani o'tkazishning mumkin bo'lgan yondashuvlaridan biridir. Ushbu texnikaning kashshoflari Charlz Sibli va Jon Ahlquist qushlar (Sibley-Ahlquist taksonomiyasi) va primatlarning filogenetik munosabatlarini o'rganish uchun DNK-DNK gibridizatsiyasidan foydalanganlar.
Biologiya uchun ahamiyati
DNK-DNK gibridizatsiyasi bakterial turlarni ajratishning oltin standarti boʻlib, oʻxshashlik qiymati 70% dan ortiq boʻlib, solishtirilgan shtammlar turli turlarga tegishli ekanligini koʻrsatadi. 2014-yilda bakterial kichik turni ajratish uchun 79% oʻxshashlik chegarasi taklif qilingan.
Tanqidchilarning ta'kidlashicha, bu usul yaqin turlarni solishtirish uchun noto'g'ri, chunki organizmlar orasidagi ortologik ketma-ketliklar o'rtasidagi farqlarni o'lchashga bo'lgan har qanday urinish organizm genomidagi paralogik o'xshashlarning duragaylanishi bilan to'lib-toshgan. DNK ketma-ketligi va hisoblash ketma-ketligini taqqoslash hozirda genetik masofani aniqlashda keng qo'llaniladigan usul bo'lib qolmoqda, ammo bu yondashuv hali ham mikrobiologiyada bakteriyalarni aniqlashda qo'llaniladi.
Hozirgi usul - to'liq yoki qisman ketma-ket genomlardan foydalangan holda silikonda DNK-DNK gibridizatsiyasini o'tkazish. DSMZ tomonidan ishlab chiqilgan GGDC DDHga o'xshash qiymatlarni hisoblash uchun eng aniq ma'lum vositadir. Boshqa algoritmik yaxshilanishlar qatorida u ikkita genom ketma-ketligi oʻrtasidagi moslikdan ehtiyotkorlik bilan filtrlash orqali paralogik ketma-ketliklar bilan bogʻliq muammoni hal qiladi.
FISH usuli
Fluoresans in situ gibridizatsiyasi (FISH) laboratoriya usuli boʻlib, koʻpincha maʼlum bir xromosomada DNKni aniqlash va ketma-ketligini taʼminlaydi.
1969-yilda Jozef Gall va Meri Lou Pardu ribosoma DNK ketma-ketligining radioaktiv nusxalari qurbaqa tuxumi yadrosidagi komplementar DNK ketma-ketliklarini aniqlash uchun ishlatilishi mumkinligini ko'rsatadigan maqola chop etishdi. Bu original kuzatishlar beri, ko'p takomillashtirish ko'p qirrali va oshdiprotseduraning sezgirligi shu darajadaki, in situ gibridizatsiya ("joyida", lotincha) hozirda sitogenetikada muhim vosita hisoblanadi. (In situ atamasi endi patologik jarayonda faqat epiteliy to‘qimasi ishtirok etgan karsinoma o‘sishining dastlabki bosqichiga nisbatan ham qo‘llaniladi.)
Flüoresan gibridlanish ketma-ketligi
RNK zondlari toʻqimalar va hujayralardagi lncRNK va miRNK mRNKni koʻrish uchun har qanday gen yoki gen ichidagi istalgan ketma-ketlik uchun moʻljallangan boʻlishi mumkin. FISH hujayra ko'payish siklini, xususan, har qanday xromosoma anomaliyalari uchun yadroviy interfazani o'rganish uchun ishlatiladi. FISH sizga arxiv holatlarining katta seriyasini tahlil qilish imkonini beradi, shunga o'xshash xromosomalarni o'ziga tortadigan sun'iy xromosoma bazasiga ega zond yaratish orqali aniqlangan xromosomani aniqlash ancha osonlashadi.
Yadro anomaliyasi aniqlanganda har bir zond uchun gibridlanish signallari: har bir mRNK va lncRNK aniqlash probi 20 juft oligonükleotiddan iborat boʻlib, har bir juftlik 40-50 bp boʻshliqni egallaydi. p. Zondlar mRNKni aniqlash uchun xususiy kimyodan foydalanadi.
DNK zondlari bilan gibridlanish
Problar ko'pincha inson genomini loyihalashda foydalanish uchun ajratilgan, tozalangan va kuchaytirilgan DNK bo'laklaridan tayyorlanadi. Inson genomining o'lchami to'g'ridan-to'g'ri ketma-ketlikda bo'lishi mumkin bo'lgan uzunlikka nisbatan shunchalik kattaki, uni ikkiga bo'lish kerak.parchalar. Oxir-oqibat, bu fragmentlar har bir fragmentning nusxasini ketma-ketlikka xos endonukleazlardan foydalangan holda yanada kichikroq birliklarga hazm qilish yo'li bilan buyurtma qilingan va har bir kichik bo'lakning o'lchamini katta bo'laklarning bir-biri bilan qaerga o'xshashligini aniqlash uchun ushbu ma'lumotlardan foydalangan holda o'lchamni istisno qilish xromatografiyasidan foydalangan holda o'lchash uchun qilingan..
Elementlarni individual DNK ketma-ketligi bilan saqlab qolish uchun parchalar doimo takrorlanadigan bakteriya populyatsiyalari tizimiga qo'shildi. Bakteriyalarning klonal populyatsiyalari, har bir populyatsiya bitta sun'iy xromosomani saqlaydi, butun dunyo bo'ylab turli laboratoriyalarda saqlanadi. Sun'iy xromosomalar (BAC) kutubxonasi bo'lgan har qanday laboratoriyada o'stirilishi, olinishi va etiketlanishi mumkin. Genomik kutubxonalar ko'pincha ular ishlab chiqilgan muassasalar nomi bilan ataladi. Misol tariqasida Buffalodagi Rosvel saraton instituti nomi bilan atalgan RPCI-11 kutubxonasini keltirish mumkin (Nyu-York, AQSh). Bu qismlar taxminan 100 ming tayanch juftni tashkil qiladi va ko'pchilik FISH zondlarining asosi hisoblanadi.
