Molekulyar biologik tadqiqot usullari zamonaviy tibbiyot, sud tibbiyoti va biologiyada katta rol o'ynaydi. DNK va RNKni o'rganishdagi yutuqlar tufayli odam organizm genomini o'rganish, kasallikning qo'zg'atuvchisini aniqlash, kislotalar aralashmasidagi kerakli nuklein kislotani aniqlash va hokazo.
Molekulyar biologik tadqiqot usullari. Bu nima?
70-80-yillarda olimlar birinchi marta inson genomini ochishga muvaffaq bo'lishdi. Bu voqea gen muhandisligi va molekulyar biologiyaning rivojlanishiga turtki berdi. DNK va RNKning xossalarini o'rganish shuni ko'rsatdiki, endi bu nuklein kislotalardan kasallik tashxisini qo'yish, genlarni o'rganish uchun foydalanish mumkin.
DNK va RNK olish
Molekulyar biologik diagnostika usullari boshlang'ich materialning mavjudligini talab qiladi: ko'pincha bu nuklein kislotalar. Ushbu moddalarni tirik organizmlar hujayralaridan ajratib olishning bir necha usullari mavjud. Ularning har biri o'zining afzalliklari va kamchiliklariga ega va bu zarursof nuklein kislotalarni ajratib olish usulini tanlashda e'tiborga oling.
1. Marmur bo'yicha DNKni olish. Usul moddalar aralashmasini alkogol bilan davolashdan iborat bo'lib, buning natijasida sof DNK cho'kadi. Ushbu usulning nochorligi agressiv moddalar: fenol va xloroformdan foydalanishdir.
2. Boom bo'yicha DNKning izolyatsiyasi. Bu erda ishlatiladigan asosiy modda guanidin tiosiyanat (GuSCN). Bu maxsus substratlarda dezoksiribonuklein kislotaning cho'kishiga hissa qo'shadi, keyinchalik uni maxsus tampon yordamida to'plash mumkin. Biroq, GuSCN PTC inhibitori bo'lib, uning cho'kma DNKga tushadigan kichik bir qismi ham nuklein kislotalar bilan ishlashda muhim rol o'ynaydigan polimeraza zanjiri reaktsiyasining borishiga ta'sir qilishi mumkin.
3. Nopoklarni cho'ktirish. Usul avvalgilaridan farq qiladi, chunki cho'kma dezoksiribonuklein kislotaning molekulalari emas, balki aralashmalardir. Buning uchun ion almashtirgichlar qo'llaniladi. Kamchilik shundaki, barcha moddalar cho'kma hosil qila olmaydi.
4. Ommaviy skrining. Bu usul DNK molekulasining tarkibi haqida aniq ma'lumot kerak bo'lmagan, ammo ba'zi statistik ma'lumotlarni olish kerak bo'lgan hollarda qo'llaniladi. Bu nuklein kislotaning tuzilishini yuvish vositalari, xususan, ishqorlar bilan ishlaganda buzilishi mumkinligi bilan izohlanadi.
Tadqiqot usullari tasnifi
Barcha molekulyar biologik tadqiqot usullari uchta katta guruhga bo'lingan:
1. Amplifikatsiya (ko'p fermentlar yordamida). Bu yerdako'pgina diagnostika usullarida katta rol o'ynaydigan PCR - polimeraza zanjiri reaktsiyasiga ishora qiladi.
2. Kuchaytirmaydigan. Ushbu usullar guruhi nuklein kislotalar aralashmalarining ishlashi bilan bevosita bog'liq. Misollar 3 ta nuqta, in situ gibridizatsiya va boshqalar.
3. Muayyan prob DNK yoki RNK bilan bog'langan zond molekulasidan signalni tanib olishga asoslangan usullar. Masalan, gibrid suratga olish tizimi (hc2).
Molekulyar biologiya tadqiqot usullarida qoʻllanilishi mumkin boʻlgan fermentlar
Ko'pgina molekulyar diagnostika usullari keng ko'lamli fermentlardan foydalanishni o'z ichiga oladi. Quyida eng ko'p qo'llaniladiganlar:
1. Cheklov fermenti - DNK molekulasini kerakli qismlarga "kesadi".
2. DNK polimeraza - dezoksiribonuklein kislotaning ikki zanjirli molekulasini sintez qiladi.
3. Teskari transkriptaza (revertaza) - RNK shablonida DNK sintez qilish uchun ishlatiladi.
4. DNK ligaza - nukleotidlar o'rtasida fosfodiester bog'larini hosil qilish uchun javob beradi.
5. Eksonukleaza - dezoksiribonuklein kislota molekulasining terminal qismlaridan nukleotidlarni olib tashlaydi.
PCR DNKni kuchaytirishning asosiy usulidir
Polimeraza zanjiri reaktsiyasi (PCR) zamonaviy molekulyar biologiyada faol qo'llaniladi. Bu bitta DNK molekulasidan juda ko'p nusxa olish mumkin bo'lgan usul (molekulalar kuchaytiriladi).
PCR ning asosiy funktsiyalari:
- diagnostikakasalliklar;
- DNK segmentlari, genlarini klonlash.
Polimeraza zanjiri reaktsiyasini amalga oshirish uchun quyidagi elementlar talab qilinadi: dastlabki DNK molekulasi, termostabil DNK polimeraza (Taq yoki Pfu), deoksiribonukleotid fosfatlar (azotli asoslar manbalari), primerlar (1 DNK molekulasi uchun 2 ta primer).) va barcha reaktsiyalar mumkin bo'lgan bufer tizimining o'zi.
PCR uch bosqichdan iborat: denaturatsiya, primerni yumshatish va cho'zish.
1. Denaturatsiya. Tselsiy bo‘yicha 94-95 daraja haroratda DNKning ikki zanjiri orasidagi vodorod bog‘lari buziladi va buning natijasida ikkita bir zanjirli molekula hosil bo‘ladi.
2. Primerni yumshatish. Tselsiy bo‘yicha 50-60 daraja haroratda primerlar bir ipli nuklein kislota molekulalarining uchlariga komplementarlik turi bo‘yicha biriktiriladi.
3. Cho'zilish. 72 daraja haroratda dezoksiribonuklein kislotaning qizi ikki zanjirli molekulalarining sintezi sodir bo'ladi.
DNK ketma-ketligi
Molekulyar biologik tadqiqot usullari koʻpincha dezoksiribonuklein kislota molekulasidagi nukleotidlar ketma-ketligini bilishni talab qiladi. Genetik kodni aniqlash uchun ketma-ketlik amalga oshiriladi. Kelajakning molekulyar diagnostikasi inson ketma-ketligidan olingan bilimlarga asoslanadi.
Keyingi tartiblash turlari ajratiladi:
- Maksam-Gilbert ketma-ketligi;
- Sanger ketma-ketligi;
- pirosequencing;
- nanoporketma-ketlik.
