Oqsilning molekulyar og'irligini aniqlash usullari kimyoviy, fizik-kimyoviy va fizik hisoblanadi. Eng keng tarqalgan fizik-kimyoviy usullar jel xromatografiyasi (ham ustun, ham yupqa qatlam) va natriy dodesil sulfat ishtirokida poliakrilamid jel muhitida elektroforezdir. Ular murakkab uskunalar va katta miqdordagi sinov materiallarini talab qilmaydi.
Protein xarakteristikasi
Oqsillar biologik kelib chiqishi yuqori molekulyar polimerlardir. Ular peptid bog'lari bilan ketma-ket bog'langan aminokislotalardan iborat. Proteinlarning hajmi xuddi shu aminokislotalarning soniga bog'liq. Proteinlarning elementar tarkibining o'rtacha qiymatlari %:
- uglerod - 50, 6-54, 5 oralig'ida;
- kislorod - 21,5-23,5 ichida;
- azot - taxminan 15,0-17,6;
- vodorod - 6, 5-7, 3 oralig'ida;
- oltingugurt – 0, 3-2, 5 ichida;
- mineral moddalar - 0,5 dan ko'p emas.
Oqsillar oddiy, faqat aminokislota qoldiqlaridan tashkil topgan va murakkab, shu jumladan protezli guruhlarga bo'linadi. Protein bo'lmagan komponentlar uglevodlar, lipidlar, nuklein kislotalar, vitamin hosilalari, metall ionlari, gem va boshqalar bo'lishi mumkin. To'rtta protein tuzilishi mavjud.
Oqsillarning aminokislotalar tarkibi kislota gidrolizi va ion almashinadigan xromatografiya yordamida chiqarilgan aminokislotalarni keyingi ajratish bilan birga topiladi.
Har bir aminokislotaning miqdoriy ko'rsatkichlari ningidrin usuli bilan aniqlanadi. Protein molekulasida aminokislotalarning joylashishini aniqlash fermentlar yordamida terminal aminokislotalarni ketma-ket parchalash va ularni aniqlash orqali amalga oshiriladi, bu esa oqsil molekulasining tuzilishini aniqlash imkonini beradi. Identifikatsiya qilish ularning turli fizik-kimyoviy xususiyatlariga asoslanadi. Buning uchun ko'pincha ma'lum aminokislotalar uchun rang reaktsiyalari va xromatografiya qo'llaniladi.
Ustunli jel xromatografiyasi
Bu usul koʻpgina globulyar oqsillarning molekulyar ogʻirligi va toʻldirilgan gel bilan (maʼlum bir gʻovak oʻlchamidagi) elutsiya hajmining logarifmining chiziqli bogʻliqligiga asoslangan. Shunday qilib, oqsilning molekulyar og'irligini aniqlash uchun faqat oldindan kalibrlangan ustundan uning elutsiya hajmini topish kerak. Kalibrlash molekulalarning oldindan belgilangan massalari bo'lgan oqsillarni ustun orqali o'tkazish va ularning har birining elutsiya hajmlarini o'lchash orqali amalga oshiriladi. Agar Sephadex G-75 to'ldiruvchi sifatida ishlatilsa, molekulyar og'irlikni hisoblash tajribada topilgan tenglama bo'yicha amalga oshiriladi:
lg M=5, 624 – 0, 752 (Ve / Vo), bu yerda M - kerakli molekulyarvazn; Ve – tekshiriluvchi moddaning kolonadan chiqib ketishi bilan eritmaning hajmi; Vo – bepul ustun hajmi.
Tahlil uchun sizga koʻk dekstran eritmasi (1%), NaCl eritmasi (0,1 mol/l), Sephadex G-75 (4 g), gemoglobin eritmasi (1%) kerak boʻladi.
Tahlil qilish
Tayyorlangan ustun Sephadex G-75 jeli bilan to'ldiriladi va NaCl eritmasi bilan yuviladi. Jel sathidan yuqoriga ko'tarilgan NaCl eritmasi drenajlangandan so'ng, uning yuzasiga 0,5 ml ko'k dekstran eritmasi ehtiyotkorlik bilan qo'yiladi. Keyin, ustundan chiqadigan suyuqliklar gradusli tsilindrga yig'iladi, ular tajriba oxirigacha saqlanadi. Oqib chiqa boshlagan ko'k rangli eritma oldindan tayyorlangan probirkalarga 20 tomchi tomiziladi. Ulardan olingan elyuat, birinchisidan eng qizg'in rangga qadar, rangsiz fraktsiyalar allaqachon yig'ilgan bir xil gradusli silindrga quyiladi. Eritmaning rangi o'chgan probirkalarning hajmi hisobga olinmaydi.
Diyarlangan silindrda to’plangan suyuqlik hajmi ustunning bo’sh hajmidir (Vo). Keyinchalik, ustunni to'ldirish takrorlanadi, lekin ko'k dekstrin o'rniga gemoglobin eritmasi ishlatiladi. Maksimal pushti rangga ega eritma chiqarilgunga qadar o'lchov tsilindridagi elyuatning hajmi Ve qiymatiga teng. Topilgan Vo va Ve qiymatlari mos keladigan tenglamaga almashtiriladi va oqsil massasi hisoblanadi. Oqsillarning aminokislotalar tarkibi xuddi shunday usullar bilan topiladi.
Yupqa qatlamli gel-xromatografiya
Ushbu usulning printsipi shundan iboratki, oqsil eritmasi Sephadexning eng nozik qatlami bo'lgan plastinkada siljish paytida ularning aralashmasi notekis taqsimlanadi. Dastlabki boshlang'ich chiziqdan boshlab har bir oqsilning bosib o'tgan masofasidan ularning molekulyar og'irliklarining logarifmlarini toping. Yupqa qatlamli gel xromatografiyasi yordamida oqsilning molekulyar og'irligini aniqlash uchun marker oqsillari bosib o'tgan masofalarning molekulyar og'irliklarining logarifmlariga bog'liqligini aks ettiruvchi kalibrlash grafigi tuziladi. Undan allaqachon foydalanilganda, o'rganilayotgan oqsil yo'lining uzunligi va uning molekulasining massasi topiladi.
Tajriba oʻtkazish uchun sizga egilish burchagi oʻzgarmaydigan bosqich, shuningdek, xromatografik kamera kerak boʻladi. Reaktivlardan sizga Sephadex G-200 yoki G-150, natriy fosfat buferi, pH 7,4 (0,1 mol/l), bromofenol ko'k eritmasi (0,1%), CH 3eritmasikerak bo'ladi. COOH (5%), CH3COONa eritmasi (2%), protein marker to'plami, xromatografik qog'oz.
Tajriba bajarilmoqda
Birinchi navbatda, Sephadex gelini tayyorlash kerak, buning uchun uning 4 g quruq massasi ortiqcha miqdorda natriy fosfat tamponida suspenziya qilinadi, so'ngra n.o.da 3 kun davomida shishishi uchun qoldiriladi. Yonlari 20x40 sm bo'lgan shisha plastinka yaxshilab yuviladi. Unga Sephadexni qo'llashdan oldin, uning ustidagi tampon tushiriladi, so'ngra jel yaxshilab aralashtiriladi. U gorizontal joylashgan plastinkaga chinni qoshiq bilan surtiladi, so'ngra 1x22 sm o'lchamdagi shisha tayoqchani dumalab taqsimlanadi.1 mm qalinlikdagi bo'laksiz va pufakchalarsiz gel qatlami bir tekis tarqalguncha dumalab takrorlanadi. Tayyorlangan plastinka 15 daqiqa davomida havoda quritiladi va keyin xromatografik kameraga joylashtiriladi.
Fosfat buferi tashqi idishlarga quyiladi, jel bufer bilan xromatografik qog'oz bilan birlashtiriladi. Keyinchalik, kamera yopiladi va maxsus stendga joylashtiriladi. Uning moyillik burchagi 7-10 ° gacha o'rnatiladi. Toʻyintirish uchun kamerani bir kechada qoldiring.
Molekulyar og'irligi ma'lum bo'lgan oqsillarning eritmalari, shuningdek, o'rganilayotgan namunalar mikropipet bilan qo'llaniladi, har bir qismning hajmi 0,02 ml bo'lishi kerak. Plastinka gorizontal holatga qaytariladi va oqsilning qismlari ma'lum nuqtalarda qo'llaniladi. Ularning orasidagi masofa va yuqori chetidan 3 sm bo'lishi kerak Keyin kamera yopiladi va 7-10 ° burchak ostida joylashtiriladi. Jel xromatografik tahlili 4 soat davomida amalga oshiriladi.
Ajratilgan vaqtdan keyin kamera gorizontal holatda joylashtiriladi, xromatografik qog'oz chiqariladi. Shisha plastinka gorizontal holatda stendga joylashtiriladi va xromatografiya qog'ozida "replika" tayyorlanadi. Buning uchun u kolba ichiga o'raladi va asta-sekin ochilib, nozik bir jel qatlamiga qo'llaniladi. Bunday holda, qog'oz unga yopishib olishi kerak, lekin uni buzilmasligi uchun ehtiyotkorlik bilan bajarishingiz kerak. Qog'oz plastinka yuzasida 1 daqiqa davomida qoldiriladi, undan so'ng u 90 ° C haroratda 20 daqiqa davomida quritiladi. va maxsus bo'yash idishiga soling.
Natijalar transkripti
Oqsil zonalarini aniqlash uchun "replika" 3 daqiqa davomida ko'k bromofenol eritmasiga joylashtiriladi. Keyinchalikbo'yoq sirka kislotasi eritmasi bilan ikki marta yuvilishi va natriy asetat bilan mahkamlanishi kerak. Shundan so'ng, xromatografik qog'oz sovuq suvda yaxshilab yuviladi va quritiladi. Keyin ular har bir oqsilning boshlang'ich nuqtasidan nuqta markazigacha bo'lgan masofani o'lchashni boshlaydilar.
Olingan ma'lumotlarga ko'ra, kalibrlash grafigi abtsissa o'qi bo'ylab la/lst (bu erda a indeksi tahlil qilinganga, st esa standart oqsilga), y o'qi bo'ylab - lgM ga tegishli. Sinov namunasining oqsil mintaqasi orasidagi masofani boshidan o'lchab, molekulyar og'irligi va oqsil molekulasining tavsiya etilgan tuzilishi chizilgan grafik yordamida aniqlanadi.
